生物药制备纯化工艺优化的目的（简述生物药提取纯化的基本工艺流程）
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典型生物药物的一般制造流程是什么
一般生物制药的主要流程如下：1. 上游阶段
1.1 目的基因的制备
目的工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中,创造出具有高度应用价值的新物种. 为此必须从现有生物群体中,根据需要分离出用于克隆的次类基因,这样的基因称之为目的基因. 基因工程中获得的目的基因主要用于: (1).研究该基因,分析其结构,功能和表达的调空机制 (2).和正常基因比较,找出基因的异常点,探索疾病发生的分子生物学基础. (3).研究生物种系的进化 (4).建立基因疗法,将正常基因引入病人体内,治疗遗传性疾病(5).大量表达某种基因,生产出需要的蛋白和多肽 (6).对某些基因进行改选,改良动植物品种.
不同基因组类型的基因组大小不同,基因组和基因排列也各不相同,因此,分离目的基因应采用不同的途径和方法
1.1.1 构建cDNA基因文库分离法
cDNA文库是以真核细胞中分离纯化出所有的mRNA,在以mRNA为模板合成cDNA与适当的载体重组转入宿主细胞,这样建立起来的cDNA重组分子集合体称为cDNA文库.而cDNA文库中插入片段的总和可代表某一种生物全部的mRNA序列.
1.1.1.1 cDNA文库的构建
构建cDNA文库主要包括以下步骤: (1).细胞总RNA的制备及mRNA的分离 (2).以mRNA为模板,合成cDNA第一条链 (3).双链cDNA的合成,而将mRNA—DNA杂交分子转变为双链cDNA分子 (4). CDNA与载体的连接和噬菌体颗粒的包装及传染或质粒的转化等
1.1.1.2 cDNA克隆的优越性
自20世纪70年代初说创cDNA克隆问世以来,以采用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了许多目的基因的cDN**段.在基因工程操作中,也长以cDNA为探针从基因文库中分离相应的基因克隆.因此, cDNA克隆常常以基因分离和结构分析的着手点,在分子生物学研究和基因工程应用等方面具有十分重要的意义.
1.1.2 构建基因组文库分离法
1.1.2.1 基因组文库的概念
将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,分别与适合的载体重组后导入宿主细胞,这些重组分子中插入片段的总和可代表该生物全部基因组序列.这种通过重组,克隆方法保存在宿主细胞中的各种DNA重组分子的集合体称为基因组文库.
1.1.2.2 基因组文库的大小
克隆片段的平均大小/bp 基因组的大小/bp
2×10^6(细菌) 2×10^7（真菌） 3×10^9（动物）
LN SJ LN SJ LN SJ
5×10^3 400 1831 4000 18418 600000 2736110
10×10^3 200 919 2000 9208 300000 1381550
20×10^3 100 458 1000 4603 150000 690774
40×10^3 50 278 500 2300 75000 345386
一个理想的基因组文库因该是在克隆群体中包含完整基因组的所有DNA序列.这就要求在打断基因组DNA时尽可能做到随机切割,实际上,无论采用什么方法的不能达到理论上的切割.应此构建的基因组文库应包含的克隆子数理论值和经验值之间相差比较大.几类基因组文库的大小见下表: 「2」
1.1.2.3 构建基因组文库的类型
通过克隆，重组方法构建的基因组文库主要有：
(1)构建λ噬菌体基因组文库；（2）构建考斯质粒基因组文库
(3) 构建YAC基因组文库
1.1.3 直接分离法
1.1.3.1 限制性核酸内切酶酶切分离法
限制性核酸内切酶酶切分离法适于简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA分子小的只有几千碱基，大的也不超过几万碱基，编码的基因较少，获得的目的基因方法比较简单。
1.1.3.2 基因分离的物理化学法
这是基因工程在发展初期所用的方法，某些生物的rDNA基因最早都是利用该法分离获得的，但目前很少采用。次方法主要有：密度梯度离心法、单链酶解法和分子杂交法等。1.1.3.3 双抗体免疫法分离编码蛋白的基因
双抗体免疫法分离编码蛋白的基因适于某一真核细胞的蛋白质已被分离纯化，且足以产生抗体。
1.1.3.4 利用酶促反转录发直接从特定mRNA分离基因
酶促反转录主要用于合成分子质量较大，转录产物mRNA易分离目的基因。
目的基因的mRNA为模板 逆转录酶 cDNA DNA聚合酶双链 双链cDN**段
与合适载体重组并转入受体菌 cDNA克隆
1.2 目的基因的分离
通过适当的方法构建上一个完整的基因组DNA文库或CDNA文库，意味着包含目的基因在内的所有基因都得以克隆，但并不等于完成了目的基因的分离。因为在基因文库中，不论是CDNA文库还是基因组文库，含目的基因的克隆子都只是数以万计的克隆子中的一个，其中究竟哪个克隆子含有我们所需要的目的基因序列还不清楚。因此，还需要下一个步骤要进行的就是目的基因的分离，主要方法有：
（1）目的基因的功能克隆 （2）序列克隆法
（3）利用差示分析法分离目的基因克隆 （4）功能结合法筛选目的基因
（5）DNA插入诱变法分离目的基因 （6）应用基因定位克隆技术分离筛选目的基因
（7）基因的定位侯选克隆法 （8）染色体显微切割与微克隆法
（9）根据生物大分子内的相互作用分离目的的CDNA克隆
（10）筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术
1.3 基因克隆载体
载体是携带目的基因的DN**段进入受体细胞进行扩增和表达的工具。常用的载体是经过改造的细菌质粒，噬菌体，黏粒和病毒
1.3.1 质粒克隆载体
质粒是细菌染色体外的双链环状的能自我复制的小分子DNA，其对细胞本身的生长繁殖不是必需的，但可以赋予细菌一定的类型，如耐热型等。
与构建克隆载体相关的质粒性质有：
（1） 粒的复（2） 制型（2）质粒的不（3） 相容性
（3）质粒的接合性
（4）质粒作为基因工程载体需要具备的条件：作为基因工程载体的质粒都是经过人工改造过的质粒，具备以下特点：
a, 相对分子质量小3—10kb b, 是松弛型复制质粒
c, 是非接合型质粒 c, 质粒上有多个限制酶的单一切点
d, 带有双选择标记
1.3.2 病毒（噬菌体）克隆载体
病毒主要由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞，利用宿主细胞的合成系统进行DNA(或RNA)复制的壳蛋白质的合成，实现病毒颗粒的增殖。人们利用这些性质构建了一小列分别适用于不同生物的病毒克隆载体。通过此种方法构建成的基因克隆载体主要有：
（1） 噬菌体克隆载体cosmid克隆技术（黏粒） （2）Μ13噬菌体克隆载体
（2） aMV克隆载体 （4）烟草花叶病毒（ TMV）载体克隆
（5）SVCO克隆载体 （6）反转录病毒克隆载体
（7）腺病毒克隆载体 （8）痘苗病毒克隆载体
（9）杆状病毒表达克隆载体
1.3.3 其他类型的克隆载体
（1）染色体定位整合克隆载体（2）人工染色体克隆载体
（3） 特殊用途克隆载体：如启动子探针型，（4） 诱导型，（5） 反义表达组织特异表达，（6） 分泌型表达，（7） 双启动子，（8） 串族启动子和含增强子表达克隆载体等等
1.4 目的基因和载体的连接（重组）
目的基因和载体连接前要先用同一种限制酶将目的基因和载体切割成黏性端或平端，也可以用物理方法切割后再用酶补成平端
体外连接是基因工程的重要环节，体外连接要减少载体的自身环化，提高重但子阳性率。主要的连接方法有：黏性末端连接、平端连接、定向插入和同源多聚尾。
1.5 重组体导入受体细胞
外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组的DNA分子。该重组DNA分子必须导入适宜的受体细胞在中才能使外源目的基因得以大量扩增或表达。随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到简单的真核细胞，进一步达到结构复杂的高等动，植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。选择适宜的受体细胞已经成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一
1.5.1 受体细胞的选择要求
目的基因获得后,必须在合适的宿主细胞中才能进行表达,才能获得目的产物.应此,宿主细胞必须满足:容易获得较高浓度的细胞;能利用易得廉价的材料;不致病、不产生内毒素;发热量低,需氧低,适当的发酵温度和细胞形态;容易进行代谢调控;容易进行DNA重组技术操作技术;产物的产量、产率高,产物容易提取纯化.
1.5.2 受体细胞的类型
人们通过研究,根据需要获得了一定的目的产物,而目的基因能否的到有效的表达,关键在与受体细胞的选择.
1.5.2.1 原核生物细胞
由于原核生物作为基因工程受体具有其他生物所没有的优点,而且人们对其遗传背景清楚,所以早期开展的基因工程操作,都是以原核生物为受体细胞.目前研究比较多的有:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等.
1.5.2.2 真核生物细胞
由于真核生物的细胞结构、基因组成和基因表达较为复杂,适用于原核生物的转基因方法大多数难以有效地用于真核生物.近年来经过探索,发现它可以对表达的蛋白质进行翻译后加工过程,有利于保持天然结构和生物活性.并用这些方法有效的获得了转基因真核生物.研究较多的有:酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等等.
1.5.3 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染和转导过程中,并非所有的的受体细胞 都能被导入重组DNA分子.一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞,同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖.因此,如何将被转化细胞从大量受体菌细胞中初步筛选出来,然后进一步检测到含有期待重组DNA分子的克隆子将直接关系到基因克隆和工程操作红极为重要的环节.
重组子的筛选可以根据载体的类型、受体细胞种类以及外源DNA分子导入受体细胞的手段等采用不同的方法,一般包括以方面:
(1).遗传直接筛选法; (2),核算分子杂交检测法; (3)依赖于重组子结构特征分析的筛选法;
(4)免疫化学检测法; (5)转译筛选法; (6)亚克隆法; (7)插入失活法;
(8)电子显微镜作图检测法; (9)基因表达产物分析法; (10)DNA序列分析法.
1.6、外源基因的表达
基因工程技术的核心是基因表达技术。迄今为止，已构建了多种基因表达系统，包括原核生物和真核生物基因表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。
1.6.1 基因表达的机制（过程）
1.6.1.1 外源基因的起始转录
外源基因在宿主细胞中的有效表达是基因工程的核心问题，而外源基因的起始转录又是基因表达的关键。
1.6.1.2 mRNA的延伸与稳定性
外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。
mRNA的稳定性直接导致决定翻译产物的多少，对原核细胞来说，最佳的方法是选择一个RNase缺失受体前。对真核细胞来说则需考虑增加mRNA的正确加工，提高成熟mRNA的稳定性。
1.6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译
翻译是mRNA指导多肽链生成的过程，翻译的起始是多种因子协同作用的过程，其中包括mRNA,16SrRNA,fMet-tRNA之间的碱基配对，还有mRNA序列上的终止密码对正确翻译的效率有很大影响。
1.6.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性
外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶所水解是基因有效表达的一个重要因素，因此，为了避免此现象的发生可从以下几个方面考虑：
（一）构建融合蛋白表达系统; （二）构建分子体蛋白表达系统;
（三）构建包涵体表达系统; （四）选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统.
1.6.1.5 目的基因沉默
基因沉默是导致外源基因不能正常表达的重要因素。它的作用机制主要有三种：位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。基因沉默现象主要表现在转基因动物和植物中。
目的基因沉默是在核酸水平上DNA与DNA,DNA与RNA,RNA与RNA相互作用的结果。由于重复序列或同源系列是基因沉默的普通原因之一，因而在构建表达载体时，应尽可能避免与内源序列具有较高的同源性。此外，可以通过选择甲几基化酶活性较弱的受体细胞或以化学物质处理受体细胞抑制甲基化作用。
1.6.2 基因表达的调控元件
通过研究发现主要的基因表达调控元件有：启动子、增强子、终止子、衰减子、绝缘子和反义子
1.6.3 外源基因表达系统
外源基因表达系统泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效的表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。由此可知，外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。基因表达系统有原核生物表达系统和真核生物表达系统。目前，利用较多的是原核生物表达系统，因其遗传背景清楚，繁殖快，表达率高等特点。近年来，真核生物基因表达系统发展很快，因其可以对表达的蛋白质进行翻译后加工过程，有利于保持天然结构和生物活性等优点。目前主要应用的表达系统有：大肠杆菌基因表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞基因表达系统、植物细胞基因表达系统；还有最新研究的两个新的表达系统[3]：巴斯德毕赤酵母表达系统和动物乳腺生物反应器——全新的生产模式。
2、下游阶段
基因工程只要的过程关键在于上游阶段，因它可以获得有效的工程菌，但下游纯化阶段也必不可少。因此为了获得合格的目的产物，必须建立相应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。
2.1、基因工程菌发酵：
良好的发酵工艺对表达外源蛋白至关重要，直接影响下游纯化工艺，形象到产品的质量和生产成本，决定产品在市场上的竞争力。目前，基因工程菌培养常用方法有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定培养。近年来，生物药品已进入生物技术时代，对基因工程菌的培养设备要求十分严格，主要采用新型自动化发酵罐。
2.2、分离纯化的基本过程：
分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的
一环,这是由于工程菌经过大规模培养后，产生的
有效成分含量低，杂质含量高；另外由于基因工
程药物是从转化细胞，而不是从正常细胞生产的，
所以对产品的纯度要求也高于传统产品，主要的
步骤如右表：[4]
2.2.1、建立分离纯化工艺根据
主要根据：（1）含目的产物的起始物料特点;
（2）物料中杂志的种类和性质;
（3）目的产物特性;
（4）产品质量的要求.
2.2.2、选择分离纯化方法的依据：
主要依据：
(1) 根据产物表达形式来选择;
(2) 根据分离单元之间的衔接选择;
(3) 根据分离纯化工艺的要求来选择.
2.2.3、常用的分离纯化方法（见下表）[5]
方法 目的
离心/过滤 去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质(如病毒)
阴离子交换层析 去除杂质蛋白、脂质、DNA和病毒等
阳离子交换层析 去除牛血清蛋白或转铁蛋白等
超滤 去除沉淀物及病毒
疏水层析 去除残余的杂蛋白
凝胶过滤 与多聚体分离
0.22μm微孔滤膜过滤 除菌
3、基因工程药物：
自20世纪80年代初第一种基因工程产品——人胰岛素投放市场以来，以基因工程药物为主导的基因工程应用已成为全球发展最快的产业之一。随着生物技术的快速发展，基因工程药物将拥有越来越广阔的发展前景。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核苷酸药物等，它对预防和治疗人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿疾病等有重要作用。
3.1、基因工程激素类药物
激素是一类由生物体内分泌腺或特异性细胞产生的微量有机物，通过体液或细胞外液运送到特定的作用部位，能引起特殊的生理效应。基因工程的激素类主要指通过基因工程方法合成的蛋白多肽类激素。目前被批准上市的激素类药物有胰岛素、人生长激素、人促卵泡激素等。
3.2、基因工程细胞因子类药物
细胞因子是由细胞分泌的能够调节生物有机体生理功能，参与细胞的增殖，分化和凋亡的小分子多肽类物质。目前被批准上市的产品有十多种。主要有：干扰素（IFN）、集落刺激因子（CSF）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF），趋化因子和生长因子（GF）等。它们的生物学功能主要表现为：调节免疫应答、抗病毒、抗肿瘤、调节机体造血功能和促进炎症反应等。
3.3、基因工程疫苗：
直接利用微生物制备疫苗来治疗疾病取得了巨大的成就，但由于各种传染病在世界范围内广泛存在，并不断有新的致病微生物被发现，它们对人类的健康造成巨大威胁。利用基因工程方法制备疫苗对控制传染病的复发和治疗新的传染病有重要意义。目前研究的基因工程疫苗包括：痢疾菌苗、霍乱菌苗、结核菌苗、流感菌苗、狂犬病疫苗、疟疾疫苗、口蹄疫疫苗。
3.4 特殊基因工程药物—防御素
防御素是一类在生物界广泛存在的、富含半胱氨酸,具有微生物和一些恶性细胞抗性的小分子短肽.它的抗性谱十分广泛,目前以发现它不但对细菌、真菌和被膜病毒(如爱滋病病毒)有广泛的毒杀效应,对某些恶性肿瘤细胞也有毒杀作用.最近,对一些长期存活的爱滋病感染者的研究发现,他们体内的爱滋病抑制因子就是一类防御素.这一研究发现给人们战胜爱滋病带来希望.
4. 基因工程研究发展前景
基因工程问世以来短短的二十几年,显示出了巨大的活力,使传统的生产方式和产业结构发生了变化.特别是在医药行业,利用人工的方法合成了许多有用的药物及人体器官等,取得了很大的经济效益.今后,基因工程将重点开展基因组学、基因工程药物、动植物生物反应器和环保等方面的研究.通过这方面的研究、开发,对人类的生活、生存环境从根本上优化做出巨大的贡献.因此,我们相信基因工程的前景将是更加灿烂辉煌.
生化药物制备过程中需要注意哪几个方面
国内在生化药物的研究方面存在较多的问题，主要表现在以下几个方面：1、对原材料没有进行严格的控制;2、无病毒灭活的工艺步骤;3、质量研究内容不够全面等。致使审评人员难以把握其质量，且产生了更多的安全性担忧。
一、生化药物的制备方法生化制药就是将动物、植物或微生物机体内的生物活性物质在其结构和功能不遭破坏的前提下，采用多种生化分离的方法提取、纯化的工艺过程。生化制药的六个阶段：1、原料的选择和预处理;2、组织及细胞的破碎;3、从破碎的细胞中提取有效成分制成粗品;4、采用多种生化技术从粗品中将目的物精制出来;5、干燥及保存;6、制剂。以上各阶段在不同的生化药物制备中，根据所选材料的不同，可灵活取舍选择使用。
生化药物的分离纯化方法主要有五类：1、根据分子大小和形状不同进行分离，如凝胶过滤法、透析和超滤法、密度梯度离心法等;2、根据分子的带电性质进行分离，如离子交换层析法、电泳法、等电聚焦法;3、根据分子极性大小及溶解度不同进行分离，如等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、逆流分配法等;4、根据配体特异性进行分离，如亲和层析法;5、根据物质吸附性质不同进行分离，如选择性吸附和吸附层析法。
二、生化药物质量控制研究要点生化药物复杂多样，在此仅针对脏器提取的多组分生化药物进行讨论，其它生化药物可参考。
(一)、脏器生化药物脏器生化药是指从动物来源的生化药物，即从动物的组织、器官、腺体、体液、分泌物以及胎盘、毛、皮、角和蹄甲等提取的药物。脏器生化药物中多数有效成分不明确，多属高分子物质，现在多数还不能用合成的方法生产，有的物质还需要有同时存在的其它物质的协同作用才能发挥较好的生理功能。主要的脏器生化药物1、
组织和器官来源大脑：胆固醇、脑磷脂、卵磷脂、P-物质和多种脑啡肽等;丘脑：生长激素释放因子和生长激素抑制因子等;心脏和动脉管：细胞色素C、辅酶Q10和辅酶A等;肝脏：核糖核酸、肝注射液、肝提取物、肝水解物和辅酶A等;肺脏：抑肽酶等;脾脏：脾注射液、肝-脾提取物和脱氧核苷酸钠注射液等;胃：胃膜素和胃蛋白酶等;肠及肠粘膜：P-物质、肝素和其它肝素(低分子肝素)等;眼：眼生素和眼宁等全眼提取物;骨：硫酸软骨素、硫酸软骨素A、骨肽注射液和蛋白胨等;皮：明胶和阿胶等;2、
腺体来源脑垂体：促皮质素、促卵泡激素、促黄体生成激素、生长激素、促乳激素、催产素、加压素和垂体前叶激素等;胰腺：胰岛素、胰高血糖素、胰蛋白酶、糜蛋白酶、结晶糜胰蛋白酶、胰酶、蛋白酶抑制剂、激肽释放酶(血管舒缓素)、弹性酶(弹性蛋白酶)、胶原酶、胰类肝素等;唾液腺：唾液腺素等;颌下腺：激肽释放酶等;腮腺：腮腺素等;甲状腺：降钙素、甲状腺素和干燥甲状腺提取物等;胸腺：胸腺素(胸腺肽)、胸腺生成素Ⅰ、Ⅱ和胸腺体液因子等;肾上腺：肾上腺皮质激素等;甲状旁腺：甲状旁腺素等;卵巢：松弛肽和子宫松弛因子等;睾丸：透明质酸酶等;松果体：松果体激素等;3、
体液和分泌物来源血液：组氨酸、赖氨酸、精氨酸和水解蛋白等;胆汁：人工牛黄、去氢胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸钠、胆黄素等;尿：尿激酶和绒毛膜激素等;4、
其他来源胎盘：胎盘提取物、胎盘球蛋白和白蛋白等;毛：胱氨酸、半胱氨酸、赖氨酸和精氨酸等;角和蹄甲：羚羊角、犀角代用品和妇乐宁等;蛋：溶菌酶等。
(二)、脏器生化药物的研究和质量控制要点因动物的来源复杂(包括动物的种属、健康状况、饲养环境、年龄、采集时间、采集方法等)，提取纯化工艺简单，其有效成分的含量和比例会产生较大的差异，因此，单靠质量标准不能全面控制产品的质量，而需要控制源头和工艺过程，再结合质量标准才能较有效地控制产品的质量，确保临床应用的安全性和有效性。换句话说，生化药物的质量控制重点就是要保证生产产品与临床研究样品质量一致，这种质量的一致性单凭质量标准中的质量控制指标不能全面地反映出来(这一点不同于化学药物)，必须通过严格地控制源头和工艺过程来实现，这一点类似于生物制品。1、脏器生化药物研究的一般过程研究脏器生化药物首先要固定源头(原材料)，包括动物的种属、健康状况、饲养环境(封闭饲养)、年龄、采集时间和采集方法等，并制订原材料的质量标准。然后研究合适的提取纯化方法，包括动物源性病毒的灭活和验证，确定原液(或半成品)的生产工艺;研究原液(或半成品)中的主要成分、含量、主成分的比例，以及其它成分的控制方法等，制订原液(或半成品)的质量标准。进行制剂的处方工艺研究，最后制成临床应用的制剂(成品)，并进行相应的质量研究，制订成品的质量标准。2、动物源性病毒的灭活工艺及验证因组织来源动物的种类不同，其自然携带或者感染病毒的种类也会有所不同，再加上目前动物来源的原材料可控性较差，故必须要对动物源性病毒进行灭活或去除，并对灭活或去除工艺进行验证。灭活或去除动物源性病毒，首先要了解选定动物的病毒情况，重点关注已确认对人类具有感染和致病能力的病毒(例如牛和猪的口蹄疫病毒，猪的乙型脑炎病毒等)及已有试验提示与人类疾病具有关联性的病毒(例如牛腹泻病毒，猪的戊肝病毒等)，了解病毒的生物学和对理化因素敏感性等方面的特性。检验原材料中病毒的污染程度和负载量，为采取相应的处理工艺提供研究数据。如果已知原材料中污染了对人感染或者致病的病毒，或者检出了内源性逆转录病毒、具有种属特异性的其它污染病毒，则必须废弃该原材料并妥善处理。(1)病毒的检测方法病毒的检测方法主要有体外法(采用不同种属的多种敏感细胞系进行共培养检测，在适宜的培养时间点取样检测感染性病毒，至少应盲传3代)、体内法(在没有可靠的体外试验方法时，可采用适宜的动物进行接种盲传试验，采用敏感的方法检测感染性病毒)、动物抗体产生试验(对尚没有合适的体内和体外试验方法检测的病毒，可采用不同动物观察种特异病毒的抗体产生情况，抗体产生试验特别有助于检出啮齿类动物病毒)、其他方法(电镜、ELISA、PCR、RT方法等)。病毒的检测方法应结合品种的特点和具体生产情况，综合分析后进行设计和选择，通常应有合理的依据和支持性资料。(2)病毒灭活/去除工艺尽量设计与实际生产工艺相关的及合理的病毒灭活/去除研究试验方案，尤其是特定的生产工艺步骤，模拟的工艺在试验参数及控制条件方面应与实际工艺严格保持一致。也就是说模拟的生产工艺应当尽可能代表实际生产工艺的情况;如果产生了不可避免的偏差，应对试验结果可能产生的影响给予合理的解释。有关病毒灭活/去除的技术方法，可参见《血液制品病毒去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》。(3)病毒灭活/去除工艺验证研究病毒灭活/去除工艺验证研究的目的是要获取充足的试验研究数据，以证明生产工艺中包含有效的病毒灭活/去除工艺步骤。其基本原则是生产工艺必须包含有效的病毒灭活/去除工艺步骤，若生产工艺无有效的灭活/去除病毒的作用，应根据产品的不同，在生产工艺过程中增加特定的病毒灭活/去除步骤。对脏器生化药物应包含两种机制上能够互补的有效工艺步骤。经过多年的实践，已经获得普遍认可的作法是将已知量的指示用活病毒，加入到模拟的原液或者不同生产工艺阶段的中间产品中，然后定量测定经特定工艺步骤或技术方法处理后病毒滴度下降的幅度，据此评价工艺灭活/去除病毒的效果。一般验证采用普通指示病毒，试验结果用于说明工艺步骤对一般病毒的灭活/去除能力，在适宜的范围内能够代表对同类病毒相似的清除能力;特定验证采用特定病毒(已发现的污染病毒)或者与特定病毒相似的病毒作为替代，试验结果用于说明工艺步骤对特定病毒的灭活/去除能力，生产工艺必须具有足够的清除该病毒的能力。因为特定病毒与一般病毒在理化因素敏感性、病毒结构特点、病毒颗粒大小及其它方面有差异，因此，普通指示病毒与特定病毒或特定病毒相似的病毒不具备可比性和一致性，难以互相替代。(4)指示病毒的选择指示病毒选择的原则：指示病毒应具有代表性和合理性，可用于正确评价生产工艺的病毒安全性。选择指示病毒应考虑的几个方面：1)根据生产过程中污染病毒的来源、污染环节和程度、致病性质和特点，以及其它应考虑的各种实际因素，同时结合能够用于评价验证效果的指示病毒的可获得性与相关培养试验条件，尽可能地选择具有一般代表性和特定模拟意义的多种指示病毒。2)尽可能选择可培养到高滴度的病毒;并应有可靠、有效的检测方法。3)应当考虑指示病毒可能对操作人员形成的健康危害，并采取必要的防护措施;必须注意指示病毒本身的安全性，应遵守国家有关的管理规定，属于烈性传染病毒不能使用。4)在选择普通指示病毒或/和特定指示病毒时，至少都应当包括RNA和DNA病毒、脂包膜和非脂包膜病毒。5)以生物组织原材料或组织原材料匀浆中可能出现的病毒为核心，综合考虑生产工艺、污染病毒及灭活/去除技术方法本身等各方面的特点进行选择。(5)病毒灭活/去除有效工艺步骤的评价首先要有病毒灭活/去除验证的试验资料，并证实在生产工艺过程中某特定步骤能够有效地灭活/去除病毒。对于可能起作用的每个步骤都应进行必要的评价，明确是否具有确切的病毒灭活/去除作用，并确定有效的工艺步骤。在有效的病毒灭活/去除工艺步骤后，不得进行可能引入新污染(如添加动物来源的材料)的操作(除非证明该操作完全排除病毒污染的可能性)，严格防止再污染的发生。一般将病毒感染性滴度减少4log以上的处理步骤认可为有效的病毒灭活/去除工艺步骤。但如果检测方法的最低检测限为103TCID50，即使病毒起始滴度为106TCID50，经处理后未检出病毒，也不宜算作特定的有效工艺步骤，因为处理后病毒的实际滴度有可能大于102TCID50，因此只能根据检测方法的灵敏度表示为未检出。病毒感染量的降低可以从病毒颗粒清除的量或病毒被灭活的情况两方面来评价。可能的情况下，应明确病毒滴度的下降是物理清除还是直接灭活。(6)病毒安全性的追踪观察由于检测方法、监测时间及灵敏性等各种因素的影响，临床前研究中即使动物试验，甚至是灵长类动物试验结果为阴性，也难以完全排除人类感染潜在污染病毒的风险(如潜伏期长的病毒、致病过程缓慢的病毒、感染特异性检测指标未知的病毒等)。因为不同阶段，人们对病毒危害的认识深入程度和全面性等不同，可提供的试验研究支持性资料及侧重点也有所不同;所以对动物来源的生化药物，不论是在临床研究的过程中，还是上市后均应进行必要的病毒安全性追踪观察。具体方法：针对可能污染的病毒，注意观察并设立病毒感染的评价指标。包括已知对原材料来源动物有致病性的病毒，在体内、体外试验中能够感染人类组织细胞的病毒，特别是隐性感染的病毒等;通过血清学或培养分离等临床检测，发现和验证在生产过程中未能发现的新病毒及感染特征。采用的检测方法应能够鉴别出人与动物病毒的区别，并经过验证确保方法的敏感性和特异性。在临床研究方案中应有对可疑致病病毒的检测实施方案，包括：急性感染、慢性感染、常规筛查临床隐性感染和血清阳转情况，以及用药前后检测结果的对比。通过主动检测和被动检测及时发现无症状隐性感染患者，避免在人群中可能发生的大规模播散。由于许多未知的和不确定因素的存在，最终确定污染病毒的致病性仍需要进行大量的基础研究和临床验证工作，因此，使用动物来源产品的患者，应该知道：经过病毒安全性控制的产品，虽然已经将感染病毒的风险减小到极低的程度，但并不能完全排除这种风险。3、脏器生化药物的质量控制要点根据脏器生化药物研究的一般过程，其质量控制要点主要分以下三个方面：1)固定源头(原材料)，包括动物的种属、健康状况、饲养环境(封闭饲养)、年龄、采集时间和采集方法等，并制订原材料的质量标准。2)研究合适的提取纯化方法，包括动物源性病毒的灭活和验证，确定原液(或半成品)的生产工艺;研究原液(或半成品)中的主要成分、含量、主成分的比例，以及其它成分的控制方法等，制订原液(或半成品)的质量标准。3)进行制剂的处方工艺研究，制成临床应用的制剂(成品)，并进行相应的质量研究，制订成品的质量标准。总之，脏器生化药物质量控制的核心就是全程控制(从源头到终产品，工艺过程控制和质量标准控制)。
三、生化药物研究应注意的问题因生化药物的来源复杂，不同的原材料和生产工艺得到的产品的质量会有差异，包括主要成分的含量、比例，以及其它成分的种类和/或含量等，而这些差异往往质量标准反映不出来，从严格意义上说，生化药物没有仿制。所以，在进行生化药物研究时首先要基于“不可仿制”来考虑问题。1、注重原材料和工艺过程控制，结合质量标准，较全面地控制产品的质量。2、产品上市后不要轻易更换原材料、变更生产工艺、改换剂型(尤其是水针、粉针、大输液互换)、延长有效期等。如果需要进行以上变更，应针对变更情况对产品的质量、安全性和有效性的影响(这种影响是指产品的真实质量，并不只是质量标准中的质量控制指标)进行相应的研究工作，包括药学、药理毒理和临床研究。3、因为生化药物的质量是靠全程控制来保证，其原液(或半成品)应不可以自由销售，否则不仅增大了流通环节再次染菌的可能性，又不利于成品全程的质量控制。4、动物源性病毒的灭活工艺及验证是一个需要研发者、审评人员，以及有关方面的专家共同研究和探讨的课题。因为人们对动物源性病毒的认识，以及动物源性病毒与人类感染性疾病的关系的认识是在逐步地深入，对病毒的灭活和工艺验证也会随着人们认识的提高而不断地趋于更科学和合理。以上简要介绍了生化药物的一般制备方法、工艺过程和质量研究，以及在研究过程中应注意的问题，目的是使研发者进一步了解生化药物的特性和质量控制要点，在进行生化药物研究时重视源头控制和工艺过程控制，建立生化药物全程控制的理念，尤其是在产品上市后，如果补充申请进行某些变更时，需要针对变更对产品的质量、安全性和有效性的影响进行相应的药学、药理毒理和临床研究.
制药分离纯化加工有哪些主要的单元技术及其特点
制药分离纯化加工主要的单元技术：最基本的分离方法有四种：整流，结晶，过滤，萃取。
特点：分离提纯首先要确定产物是胞内产物还是胞外产物。胞内产物先要经细胞破碎，碎片分离后提纯。分离的方法多种，常用的是过滤和离心，一些新的方法有如双水相萃取，膜分离等。提纯是对目的产物的进一步纯化处理，方法很多，比如超滤，微滤，膜分离，液膜等。
内容简介
本书介绍了药物研究、开发和生产中常用的分离纯化技术的原理、工艺、特点和应用，系统地介绍了药物的液液萃取技术、浸取分离技术、超临界流体萃取分离技术、双水相萃取技术。
制备色谱分离技术、大孔吸附树脂分离技术、分子印迹技术、离子交换分离技术、分子蒸馏技术、膜分离技术、喷雾干燥和真空冷冻干燥技术等内容。内容全面、简练，层次清晰，涵盖了化学合成药、生物药、植物药的分离纯化。
